Funktionelle Rekonstitution der Tat-Proteintranslokase in künstliche Membransysteme

Ziel dieses Forschungsvorhabens ist es, die Tat-Proteintranslokasen aus Chloroplasten und Bakterien (Tat = Twin-arginine translocation) in funktioneller Form in künstliche Membranen zu rekonstituieren und so den ungewöhnlichen Mechanismus der Membrantranslokation von Proteinen auf dem Tat-Weg einer detaillierten Analyse zugänglich zu machen. Dieser Transportweg ist strukturell und funktionell zwischen Bakterien und Chloroplasten konserviert, z.B. bezüglich der Struktur der Tat-Untereinheiten und Signalpeptide, der Abhängigkeit von einem Membranpotential und vor allem der auch für biotechnologische Anwendungen relevanten Fähigkeit, gefaltete Proteine zu transportieren. Zur Analyse soll die Tat-Translokase, die aus den drei integralen Untereinheiten TatA, TatB und TatC besteht und während des Transportprozesses transient multimere Komplexe von etwa 560 kDa und 620 kDa ausbildet, in künstliche Membransysteme (Lipidvesikel sowie planare Mono- und Bilayer) rekonstituiert werden. Die dafür notwendigen großen Mengen an Tat-Proteinen sollen durch jeweils getrennte Überexpression dieser Untereinheiten in bakteriellen bzw. eukaryotischen Systemen und anschließende affinitäts-chromatographische Aufreinigung gewonnen werden. Es sollen sowohl die bakteriellen als auch die chloroplastidären Tat-Untereinheiten präpariert und zur Rekonstitution eingesetzt werden, wobei neben den authentischen auch chimäre Tat-Translokasen generiert werden können. Mit diesen rekonstituierten Systemen soll zunächst untersucht werden, welche Voraussetzungen für die Funktionalität der Tat-Translokase erfüllt sein müssen (z.B. Vorhandensein von Transportsubstrat und/oder Membranpotential, Einfluss der Lipidzusammensetzung etc.). Anschließende Untersuchungen mit den funktionell rekonstitutierten Translokasekomplexen sollen dann den Mechanismus des Tat-Transports im Detail aufklären, wobei eine Vielzahl authentischer, chimärer und mutierter Tat-Substrate sowohl von Bakterien als auch von Chloroplasten für die Analyse zur Verfügung stehen.  Der direkte Vergleich der rekonstituierten chloroplastidären, bakteriellen und chimären Tat-Translokasen sollte es dabei ermöglichen, einerseits die allgemeinen Prinzipien des Tat-Transports abzuleiten und andererseits evolutionäre Anpassungen nachzuvollziehen.