Funktion von Transportern der RND-Proteinfamilie

In der Arbeitsgruppe Nies bildet die Untersuchung des RND-Proteins CzcA ein zentrales Forschungsthema. Dieses Protein ist Teil eines membrangebundenem Protein-Komplexes, der die Schwermetallionen Zn2+, Co2+ und Cd2+ über die Zellwand eines Gram-negativen Bakteriums transportiert und damit das Cytoplasma entgiftet [Tseng, 1999 #30; Nies, 1987 #1; Nies, 1989 #2; Nies, 1989 #3; Nies, 1989 #4; Nies, 1995 #10; Nies, 1995 #11; Nies, 1999 #32; Nies, 2000 #36]. Das Protein wurde erfolgreich gereinigt und in Liposomen rekonstituiert [Goldberg, 1999 #34]. Durch die Charakterisierung von Mutanten-CzcA-Proteinen und die Analyse der CzcA-Struktur mittels Reporterprotein-Fusionen konnte ein Funktions-Modell abgeleitet werden, nach dem CzcA als Zweikanal-Protonen-Kationen-Antiporter arbeitet [Goldberg, 1999 #34].
Wichtig ist bei diesem Modell das Postulat, dass eine periplasmatische Substrat-Bindestelle durch Protonierung und Deprotonierung in ihrer Affinität verändert werden kann. Die Protonierung erfolgt mit Protonen aus dem Periplasma, zur Deprotonierung werden diese Protonen dann ins Cytoplasma transportiert. Dadurch wird die Energie der proton motive force Dp über der Cytoplasma-Membran für diesen Vorgang genutzt, wodurch letztendlich der Export des Substrates aus dem Cytoplasma ins Periplasma durch Dp angetrieben wird. In der weiteren Forschung, für die eine Förderung nach dem DFG-Normalverfahren angestrebt wird, soll CzcA für die Röntgenstruktur-Analyse kristallisiert werden. Durch Mutanten-Studien soll die Hypothese über das generelle Funktions-Chema des Proteins zudem weiter überprüft werden.
Zur RND-Familie gehören nicht nur Transporter für Schwermetall-Kationen, sondern wichtige weitere Proteine. In der Mex/Acr-Gruppe von RND sind Proteine zu finden, die organische Moleküle entgiften und damit einen wichtigen Teil der multiple drug resistance in pathogenen Gram-negativen Bakterien darstellen können. Etwa 50% von multiple Antibiotika-resistenten klinischen Problemfällen der Art Pseudomonas aeruginosa sind auf diese Mex/Acr-Systeme zurückzuführen [Ziha Zarifi, 1999 #130]. Im PEPT-Projekt, das bisher als gemeinsames Projekt der Arbeitsgruppen Neubert/Nies bearbeitet worden ist, sollte durch Studium der Peptidtransporter der PEPT-Familie etwas über den Transport von Antibiotika gelernt werden. Dieses Projekt kam langsam voran, die angestrebte Herstellung bakterieller Modellsysteme zum Studium dieser Transporter gelang nicht, jedoch wird PEPT1 momentan für Rekonstitutions-Experimente gereinigt.
Im Gegensatz zu PEPT-Transportern wäre das Studium von Mex/Acr-Transportern wesentlich näher an das zentrale Thema der Arbeitsgruppe Nies angebunden. Im neuen gemeinsamen Projekt Nies/Neubert soll daher im Rahmen einer Promotion angestrebt werden, über das Studium der Substrat-Spezifität bakterieller RND-Transporter die Funktion von Mex/Acr-Transportern beim Export von Antibiotika zu verstehen. Dabei soll die Forschung bei CzcA beginnen und sich schrittweise über Transporter divalenter Kationen (CnrA, NccA) und Transporter monovalenter Kationen (AgrA) auf die Transporter organischer Moleküle ausdehnen. Wie beim PEPT-Thema ist hier mit scharfer Konkurrenz zu rechnen, so daß die Ausdehnung der Untersuchung auf Mex/Acr-Systeme wohl fundiert verlaufen muß.
In diesem Projekt soll damit eine Linie aufgebaut werden, die vom Kern-Projekt der AG Nies, dem CzcA-Protein, zum gemeinsamen Postdoc-Projekt der AG`s Neubert und Nies führt, den eukaryontischen RND-Proteinen. Die Linie führt von CzcA zu den Mex/Acr-Proteinen aus Escherichia coli, die wie die eukaryontischen RND-Proteine organische Moleküle transportieren. Durch Reinigung und Rekonstitution der fraglichen Proteine sowie von ausgewählten Mutanten-Proteinen sollen damit Erkenntnisse, die am CzcA-Protein gewonnen werden, über gemeinsame Funktions-Hypothesen auf die anderen Proteine übertragen werden.