Funktionelle Rekonstitution der Tat-Proteintranslokase

Unter allen Transportwegen, die für die Translokation von Proteinen über Biomembranen verantwortlich sind, ist der Tat-Weg (Twin-arginine translocation), der an der Thylakoidmembran von Chloroplasten sowie an der Cytoplasmamembran von Prokaryoten gefunden wird, gleich in mehrfacher Hinsicht einzigartig. Er benötigt keine Nukleosidtriphosphate oder andere lösliche Faktoren zur Funktion, sondern wird ausschließlich durch ein Membranpotential, meist in Form eines Protonengradienten, energetisiert. Vor allem aber ist er in der Lage, gefaltetete Proteine über die Membranen zu transportieren, wobei die Faltung des Substrats bei Bakterien sogar Voraussetzung für den Transport ist. Wie dabei der Transport unterschiedlich großer Substrate durch die gleiche Translokase bewerkstelligt werden kann, ohne das Membranpotential zu zerstören, ist noch vollkommen ungeklärt und soll deshalb im Rahmen dieses Forschungsvorhabens untersucht werden. Dazu ist vorgesehen, die Tat-Translokase, die aus den drei integralen Untereinheiten TatA, TatB und TatC besteht und die während des Translokationsprozesses transient multimere Komplexe von etwa 560 kDa und 620 kDa ausbildet, in künstliche Membransysteme (Lipidvesikel sowie planare Mono- und Bilayer) zu rekonstituieren. Die dafür notwendigen großen Mengen an Tat-Proteinen sollen durch jeweils getrennte Überexpression dieser Untereinheiten in geeigneten bakteriellen bzw. eukaryotischen Systemen und anschließende affinitätschromatographische Aufreinigung gewonnen werden. In dieser Weise sollen sowohl die bakteriellen als auch die chloroplastidären Tat-Untereinheiten präpariert und zur Rekonstitution eingesetzt werden, wobei neben den authentischen natürlich auch chimäre Tat-Translokasen generiert werden können. Mit diesen rekonstituierten Systemen, in denen störende Einflüsse anderer Membrankomponenten ausgeschlossen sind, soll dann zunächst untersucht werden, welche Voraussetzungen für die Funktionalität der Tat-Translokase erfüllt sein müssen (z.B. Vorhandensein von Transportsubstrat und/oder Membranpotential, Einfluß der Lipidzusammensetzung etc.). Anschließende Untersuchungen mit den funktionell rekonstitutierten Translokasekomplexen sollen dann den Mechanismus des Tat-Transports im Detail analysieren, wobei eine Vielzahl authentischer, chimärer und mutierter Tat-Substrate sowohl von Bakterien als auch von Chloroplasten für die Analyse zur Verfügung stehen. Der direkte Vergleich der rekonstituierten plastidären, bakteriellen und chimären Tat-Translokasen sollte es dabei ermöglichen, einerseits die allgemeine Prinzipien des Tat-Transports abzuleiten und andererseits evolutionäre Anpassungen nachzuvollziehen.